活体成像试剂：D-荧光素& 腔肠荧光素

背 景：活体成像技术（optical in vivo imaging）目前主要采用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术，生物发光法是基于荧光素酶能催化底物（D-Luciferin或Coelenterazine）化学发光的原理，将体外能稳定表达荧光素酶的细胞株植入动物体内，与后期注射入体内的底物发生反应，利用光学系统检测光强度，间接反映出细胞数量的变化或细胞的定位。这项技术已被广泛应用于多个领域，常用的有肿瘤或疾病动物模型的建立，并可用于病毒学研究、siRNA研究、干细胞研究、蛋白质相互作用研究等。  

原 理：

目前极有代表性的荧光素酶有从萤火虫中分离得到的萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）和从海肾中分离得到的海肾荧光素酶（Renilla luciferase），还有近年来研究较多的来源于夏威夷水域的一种大型海洋桡脚类(Copepod)动物获得的高斯荧光素酶(Gaussia Luciferase)，萤火虫荧光素酶的底物是D-Luciferin，海肾荧光素酶和高斯荧光素酶的底物是Coelenterazine。它们共同的作用原理是在ATP和荧光素酶的催化作用下，底物被氧化发光（不同底物光的颜色和波长不同），当底物过量时，产生的光量子数与荧光素酶的浓度呈正相关性。  

1.D-Luciferin（D-荧光素）

D-Luciferin是萤火虫萤光素酶的化学发光底物。 它在存在 ATP 的情况下通过萤光素酶氧化脱羧产生光。 D-Luciferin可用于测定与感兴趣的启动子相连的萤光素酶基因的表达。 

常见应 用：1）体外化学发光分析（in vitro）；2）活体成像实验（in vivo）；3）高灵敏度ATP分析；  

2.Coelenterazine腔肠荧光素

Coelenterazine：普遍认为是天然的腔肠荧光素，是海肾荧光素酶（Rluc）的作用底物，具有许多用途。可用于检测活细胞中钙离子浓度，基因报告分析，BRET（生物发光共振能量转移）研究，ELISA，HTS，组织或细胞中超氧阴离子和过亚硝酸盐的化学发光检测。 

Coelenterazine h:与Renilla荧光素酶或Gaussia荧光素酶使用具有一定的局限性。体外研究中比其他类似物更适合与钙离子激活发光蛋白共用。据报道，Coelenterazine h的发光强度高于天然腔肠荧光素10-20倍，因此是用来检测钙离子浓度微小变化的有力工具。

Coelenterazine 400a: 是BRET研究中Rluc的优先选择底物，此腔肠素衍生物在390 nm和400nm之间发蓝色光，对GFP acceptor的光发射干扰小。  

萤火虫萤光素酶（Firefly luciferase）是一种分子量约为61kD的蛋白，在ATP、镁离子和氧气存在的条件下，可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出波长为560nm左右的生物萤光(bioluminescence)，是目前体内外检测实验中最常用的萤光素酶。在此基础上还有用于高灵敏度检测的快速降解型萤火虫荧光素酶，例如pGL6-TA-CP(超灵敏快速降解型报告基因质粒) (D2094)。  

海肾萤光素酶(Renilla luciferase）是一种分子量约为36kD的蛋白，在氧气存在的条件下，可以催化腔肠素(Coelenterazine)氧化成Coelenteramide，反应过程无需ATP和镁离子参与。在Coelenterazine氧化的过程中，会发出波长为480nm左右的生物萤光(bioluminescence)。  

高斯荧光素酶(Gaussia Luciferase)为单条肽链的单体酶，其分子量较小(20kD)，且具有分泌性信号肽，可通过内质网分泌到细胞外。因此在使用Gaussia Luciferase的报告基因载体转染哺乳动物细胞进行表达时，无需裂解细胞，可直接使用细胞培养基上清进行萤光素酶活性的实时检测。Gaussia Luciferase萤光素酶参与催化底物腔肠素的氧化反应并且发出波长为480nm左右的萤光。与其它萤光素酶相比，  

Gaussia Luciferase作为报告基因有多方面的优势：

• 分泌型萤光素酶，可在不同时间段直接取上清检测，无须裂解细胞；

• 发光强度高，是其它萤光素酶的1000倍；

• 反应无须ATP，不受ATP影响；

• 稳定性高，对温度、pH值等耐受性强。

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