Biogradetech Comet Assay Kits 彗星分析试剂盒

*为方便客户使用试剂盒，艾美捷科技善意将其翻译成中文操作手册，请以试剂盒中配套的英文版为准。因编者翻译水平有限，对于由本说明书中不当翻译所造成的损失，概不负责，如有错误，欢迎指正！

实验开始前，建议先通读说明书（请以试剂盒中配套的英文版为准）：

      介绍：由于环境因素和细胞内正常的新陈代谢过程，DNA损伤每天以每个细胞1000到100万个分子损伤的速度发生。虽然这只占人类基因组约60亿个碱基(30亿个碱基对)的一小部分，但关键基因的未修复损伤可能会阻碍细胞发挥其功能的能力，并显著增加癌症的可能性。彗星实验（Comet assay）也被称为单细胞凝胶电泳实验（Single cell gel electrophoresis，SCGE），是一种超灵敏的单细胞水平上检测DNA损伤的技术。在电泳场下，损伤的细胞DNA(包含碎片和链断裂)从完整的DNA中分离出来，在显微镜下形成典型的“彗星尾巴”形状。DNA损伤的程度通常是通过测量彗星尾巴来目测的，也可以使用图像分析软件来测量各种参数。

OxiSelect™ Comet Assay是一种快速、灵敏的，用于测量细胞DNA损伤的试剂盒。每个试剂盒提供足够的试剂，最多可进行15次检测。

OxiSelect™ Comet Assay实验原理：Cell Biolabs 的 OxiSelect™ Comet Assay 是一种单细胞凝胶电泳法 (SCGE)，用于简单评估细胞 DNA 损伤。首先，将单个细胞与低熔点琼脂混合后，再应用到OxiSelect™ Comet特制玻片上。然后，用裂解缓冲液和碱性溶液处理这些嵌入的细胞，使DNA松弛并变性。最后，在电泳槽中对进行电泳，以分离完整的DNA和受损的片段。电泳后，样品被干燥，用DNA染料染色，并通过外显荧光显微镜可视化。在这些条件下，受损的DNA（包含裂解和链断裂）将比完整的DNA迁移更多，并产生 "彗星尾 "形状（见图1）。

图1，彗星实验原理与流程示意图

客户自备材料：

1.氯化钠粉末

2.NaOH颗粒

3.10 N NaOH，用于调整pH值 （10 N NaOH = 10 M NaOH =10 mol/L NaOH）

4.DMSO（可选）

5.70%乙醇

6.TE缓冲液（10mM Tris，pH 7.5，1mM EDTA）。

7.PBS（不含Mg2+和Ca2+）。

8.EDTA(二钠盐)

9.DI H2O（去离子水）

10.37ºC和沸水浴

11.水平电泳槽

12.可调节的单通道微量移液器，带一次性吸头。

13.带FITC过滤器的外显荧光显微镜

保存条件：收到试剂盒后，将绿色荧光DNA染料，10000X存放在-20ºC。 所有其他试剂盒组件在室温下储存。

一、试剂准备：

1.OxiSelect™ CometAgarose：将Comet Agarose瓶放在90-95ºC水浴中加热20分钟，或者直到琼脂胶液化。将瓶子转移到37℃的水浴中20分钟，并保持直到使用。

2.1X Vista Green DNA Dye工作液:使用TE缓冲液（10 mM Tris, pH 7.5, 1 mM EDTA）稀释原10000X的Vista Green DNA Dye母液，按照1:10000的比例，稀释成1X的Vista Green DNA Dye工作液。1X工作液可在4℃避光条件下保存3周。

3.Lysis Buffer: 准备100ml的1X 裂解缓冲液

* 血红素在4℃成胶状，用DMSO溶解的血红素。DMSO的添加是任选的，仅对含有血红素的样品（例如血细胞或组织样品）是必需的。加入DMSO对实验结果没有影响。

4.Alkaline Solution：准备100ml的碱性溶液

5.Electrophoresis Running Solution: 准备1L电泳缓冲液，需求选择电泳模式（二选一）：

* 实验过程中的各类缓冲液都需要4℃预冷。

5.1 TBE Electrophoresis Solution （中性）

或者5.2 Alkaline Electrophoresis Solution (300 mM NaOH, pH >13, 1 mM EDTA)（碱性）

特殊说明：为避免紫外线对细胞样品造成额外损害，请在弱光条件下进行实验。

二、准备样品和玻片：

1.准备裂解缓冲液、碱性溶液和电泳缓冲液（见试剂准备），然后再进行实验。将所有溶液彻底冷却至4ºC。

2.将OxiSelect™ Comet Agarose放在90-95ºC水浴中加热20分钟，或者直到琼脂胶液化。将瓶子转移到37℃的水浴中20分钟进行冷却，并保持直到使用。

3.在OxiSelect™ Comet玻片上，每孔加入75 ul 37℃的Comet Agarose，形成基层胶。用移液器将胶溶液涂抹在孔上，确保完全覆盖和平铺。将载玻片转移到4ºC下水平放置15分钟，使其固化。

4.按照如下方式准备细胞样品，与对照细胞：

悬浮细胞：以700×g离心2mins，弃上清，用冰冷的PBS（无Mg2+和Ca2+）洗涤细胞一次，离心，弃上清。最后，用预冷4℃的PBS（无Mg2 +和Ca 2 +）重悬细胞到1×10⁵个细胞/ml 。

贴壁细胞：轻轻地从细胞培养瓶/培养皿中取出细胞，用橡胶细胞刮处理。将细胞悬浮液转移到锥形管（EP）中，并在700×g离心2mins，弃上清。用冰冷的PBS（不含Mg2+和Ca2+）洗涤细胞一次，离心，并丢弃上清液。最后，用预冷4℃的PBS（无Mg2 +和Ca 2 +）重悬细胞到1×10⁵个细胞/ml 。

组织样品：使用解剖剪刀，切碎一小块组织到1-2ml冰冷的含20mM EDTA的PBS缓冲液（无Mg2 +和Ca 2 +）。组织/细胞悬浮液放置5分钟，然后将上清液转移到离心管中，避免转移碎片。700×g离心2mins，丢弃上清液。最后，用预冷4℃的PBS（无Mg2 +和Ca 2 +）重悬细胞到1×10⁵个细胞/ml 。

* 推荐阳性对照：使用20 uM Etoposide（依托泊苷）处理4小时。

5.将细胞悬液与Comet Agarose（步骤2）以1:10的比例（v/v），用移液枪混合均匀，并立即转移75ul 到每个孔中的原基层胶上方（步骤3）。确保完全覆盖平铺孔板，非常轻柔和小心地用移液管尖传播的悬浮液，而不干扰基层胶。

Note: 对于多个样品的处理，将细胞与Comet Agarose混合液保持在37℃，避免凝胶化。准备好样品后，重新混匀，依次取出75ul加入到玻片孔中。

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