流式抗体荧光选择技巧：PE，APC，PE-Cy5

流式抗体荧光选择技巧：在进行流式细胞仪多色分析时，如果想得到理想的分析结果，就需要选择好抗体的荧光搭配。常考虑的影响因素有以下几点：

1.荧光素的荧光强度：

一个特定抗体，能否区分阴性与阳性结果，靠的是抗体上结合的荧光素标记。每一种荧光素的光量子释放能力不同，相对荧光强度不一样，一般用染色指数（staining index）来比较不同荧光标记的光信号强度。染色指数是阳性信号和阴性信号差异与阴性峰分布宽度比值，是判断该荧光染料辨别弱阳性表达的能力。因此，对于特定的单克隆抗体，由于使用了不同的荧光素标记，其阴性细胞核阳性细胞的S/N比值（信噪比）可以相差4-6倍。一般来讲，荧光信号由强到弱的的排序是：PE>APC>PE-Cy5>PERCP-Cy5.5>FITC>PERCP。

2.荧光素标记效率：

抗体上标记荧光素的数量（F/P）值也会影响相对荧光强度。每一个抗体上可标记几个FITC或PERCP分子（通常为2-9个），而APC和PE的标记量约为每个抗体标记一个荧光分子。FITC为小分子化合物，而PE，PERCP和APC则是分子量较大的荧光蛋白。受荧光标记物的化学性质要求限制，IGM型抗体通常只用小分子的荧光素进行标记，如FITC、TEXAS RED、Cy3和Cy5。

3.抗原表达丰度：

高表达的抗原几乎可以用任何荧光素标记的抗体检测，而较低表达的抗原则需要用较高亮度的荧光素标记的抗体进行检测，从而达到有效区分阳性细胞群和阴性细胞的目的。

4.细胞自发荧光：

每个细胞群体都带有不同水平的自发荧光，由于细胞的自发荧光在高波长范围里（>600nm）迅速降低，所以在检测自发荧光水平高的细胞时，使用发射波长较长的荧光染料（比如APC）可以得到较好的检测结果。

5.非特异性结合

有些荧光标记的抗体会表现出低水平的非特异性结合，就会造成阴性细胞的荧光水平升高。

常见流式抗体荧光染料简介：

1) 藻红蛋白（phycoerythrin，PE）：PE是从红藻中分离纯化获得的一种常见染料，经激光激发后发出橙黄色荧光，最大发射波长为575 nm。PE具有吸光性能好和光量子产率高的特点，可用于标记表达水平较低的蛋白。在流式细胞术检测中，PE标记的抗体适用于所有配备488 nm氩离子激光器的流式细胞仪。

2) PE-Cy5：PE-Cy5是一种复合染料，属于藻红蛋白偶联物，在此类复合染料中，激发能量可从PE传递到Cy5上，最大发射波长为667 nm。由于PE-Cy5与FITC、PE在光谱上重叠范围较少，荧光干扰少，因此实验中常将PE-Cy5与FITC、PE搭配使用。需注意，PE-Cy5不适合与APC搭配使用，两者荧光重叠大。

3)PE-Cy5.5：PE-Cy5.5也是一种复合染料，能量从PE传递到Cy5.5上，最大发射波长为694 nm。同PE-Cy5不一样，PE-Cy5.5与FITC、PE、APC间荧光干扰小，可搭配使用，且其荧光强度要优于PE-Cy5。

4) PE-Cy7：复合染料，最大发射波长为785 nm。PE-Cy7与FITC无光谱重叠，与APC重叠也较少，因此其可与FITC、PE、APC搭配使用。在实验中需要注意，PE-Cy7的光淬灭性很强，需要绝对避光环境。

5) PerCP-Cy5.5：复合染料，最大发射波长为695 nm。PerCP-Cy5.5光量子产率高，可用于表达水平较低物质的检测，与PerCP-Cy5.5相反，PerCP的光量子产率较低，适用于表达水平较高物质的检测，在双激光管仪器上与APC共同检测时，需要做补偿调节，但比PerCP补偿少。

6) PI/7-AAD：碘化丙啶（propidium iodide，PI）和7-AAD（7-amino-actinomycin D）的最大发射波长分别为617 nm和647 nm，是常见的荧光染料，常用于细胞凋亡检测，可用于鉴别死、活细胞。在大部分流式细胞仪上，PI在FL2或FL3通道检测，7-AAD在FL3通道检测。7-AAD同PI 有着相似的荧光特性，但其发射波谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品。

7) 别藻青蛋白（allophycocyanin，APC）：APC最大发射波长为660 nm，其标记的抗体适用于所有配备氦氖激光器的流式细胞仪，检测通道一般是FL4通道。FITC、PE和APC搭配是经典3色搭配。

8) Cy5：Cy5属于小分子染料，其最大发射波长为670 nm，其标记的抗体适用于所有配备633 nm氩离子激光器的流式细胞仪，检测通道一般是FL4通道。除流式细胞术外，Cy5同样适用于传统的荧光显微镜技术。需注意的是，Cy5与单核细胞和粒细胞的非特异性结合多，实验结果容易出现假阳性。

9) 异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）：FITC是应用最为广泛的一种荧光素，经激光激发后发出明亮的黄绿色荧光，最大发射波长为525 nm。FITC的荧光强度受PH影响较大，常随着PH的降低而减弱，因此，在使用FITC时需格外注意溶液的酸碱度。

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