TheWell Bioscience-无外源性VitroGel水凝胶

引言

癌症的进展高度个体化。其机制对每个动物物种都是特定的，这使得肿瘤学研究成为生物科学中最具挑战性的领域之一。近年来，关注疾病进展的个体化性质的研究取得了非常有希望的进展；例如，患者来源的异种移植（PDX）模型，其中免疫缺陷动物体内嵌入了人类来源的肿瘤组织，揭示了一些关键的诊断和治疗信息。类似地，细胞系来源的异种移植（CDX）模型，其中使用特定的细胞系进行移植，已被证明是研究肿瘤生长和进展的重要工具，从而推动了癌症治疗的发展1,2。CDX模型也是药物发现过程中的重要中间环节。水凝胶系统，如来自广泛使用的基于动物的细胞外基质（AB-ECM），已经使用了几十年，作为体内应用的递送系统。然而，无数未定义化合物的存在导致AB-ECM批次之间的不一致性。一些实际挑战，如不稳定的细胞制备、移植排斥、对聚集的恐惧或其他粘度问题，仍然存在于当前使用的动物衍生基质中。AB-ECM的温度敏感特性也可能导致产品使用过程中的障碍。此外，AB-ECM的制造周期非常缓慢（平均4个月），这导致其支持异种移植研究不断增长的需求的能力问题。为了帮助研究人员更及时、高效地推进其临床前研究，本应用笔记讨论了TheWell Bioscience的无外源性物质、合成的、室温稳定的VitroGel?系统在CDX模型中的探索3。本应用笔记具体详细比较了在CDX小鼠模型中使用AB-ECM与VitroGel研究肿瘤特征的差异。本研究选择了CDX模型中一些最广泛使用的细胞类型。这些细胞类型跨越了几个人类组织来源，包括前列腺（PC3）、宫颈（HeLa）、乳腺（HCC1806）、结肠（HCT116）、肺（Calu-6）和胰腺（PANC1）。每种细胞系在与AB-ECM或VitroGel混合后接种到小鼠体内，以获得肿瘤体积进展的比较研究。

图1. VitroGel用于异种移植应用与基于动物的ECM相比的优势比较。

关于TheWell Bioscience的VitroGel系统用于异种移植

TheWell Bioscience的VitroGel系统是一种优秀的可注射递送系统，可作为异种移植中各种细胞类型和组织的有效载体。除了无动物源性和完全合成外，其强大的生物功能特性模拟组织微环境，支持细胞快速生长。该产品具有某些关键属性和优势，使其优于AB-ECM和其他基质，确保其成为卓越的替代品（图1）。以下是一些关键优势：

√支持体外和体内应用的150多种细胞类型

√适用于具有不同宿主类型（NSG小鼠、裸鼠、SRG大鼠等）和多个注射部位（皮下、原位等）的CDX模型和PDX模型

√可重复的测定——定义明确的合成水凝胶组成，不含未知蛋白质，无批间差异

√室温稳定——室温下易于操作的方案步骤

√长期可注射状态——在室温下保持可注射性数小时（可批量制备样品）

√注射顺畅，无针头堵塞问题

√注射后细胞保留良好

√始终有库存，无供应链问题

材料和方法

细胞系和水凝胶系统概述

肿瘤发展研究在60只无胸腺裸鼠CDX模型中进行。接种时选择的小鼠年龄为6-8周。本实验中所有小鼠均由Charles River Laboratories提供。VitroGel水凝胶基质（TheWell Biosciences；目录号：VHM01）和AB-ECM作为特定肿瘤细胞系注射的递送系统。六种细胞系，PC3、HCT-116、Calu-6、HCC1806、HeLa和PANC1，在与VitroGel或AB-ECM以配对方式混合后接种到小鼠体内，每个治疗组研究五只小鼠（表1）。这些细胞系跨越了几个人类组织来源，包括前列腺、结直肠、肺、卵巢、胰腺和乳腺（表1）。在2-10周的时间内，观察小鼠及其肿瘤的治疗组与水凝胶和AB-ECM的时间，以比较每个肿瘤达到预定肿瘤大小所需的时间。

细胞培养基和VitroGel与AB-ECM的处理

细胞在特定培养基（表1）中进行传代培养，处于指数生长期的细胞被收获。然后将细胞重悬于PBS中，不添加更多补充剂。经过一轮过滤和细胞计数后，细胞悬液随后在335 x g RCF下进行另一轮离心，然后使用PBS重悬细胞以获得所需细胞浓度的2倍。

在此步骤之后，使用VitroGel与AB-ECM的方案开始，略有变化。对于使用VitroGel的方法，首先将产品置于室温下。将细胞悬液（2倍）与VitroGel以1:1（v/v）的比例混合。转移到注射器后，将该混合物在室温下放置10-15分钟，在此期间交联开始稳定，然后进行注射。注射体积为100μL或200μL，具体取决于细胞类型，以获得所需的细胞密度（1 x 10*6、2 x 10*6或10 x 10*6，具体取决于细胞类型；见表1）。注射在小鼠背部大腿区域附近皮下进行。

对于AB-ECM，将溶液解冻并在整个方案中保持在4°C。然后将细胞悬液（2倍）与AB-ECM以1:1的比例（v/v）混合。同样，装载体积为100μL或200μL，以获得所需数量的细胞；对于配对的VitroGel和AB-ECM实验，每个细胞类型的细胞数量相等。在每轮接种后，将注射器放回冰上，以防止悬浮液凝固和针头堵塞。协议组件的详细信息可在下面的表1中找到。

 表1. VitroGel和AB-ECM使用的培养基、注射次数、体积和品系的详细信息保持相似。

肿瘤追踪分析

每周使用卡尺测量肿瘤大小两次。体积以立方毫米表示，使用公式：V（mm?）=（a（长度）×b（宽度）?）/2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。使用Microsoft Excel计算每个时间点（最多五只；个体在体重减轻超过20％、过度应激或死亡时从研究中移除）的小鼠样本的平均值和标准差。实验持续进行，直到达到预定的肿瘤大小（例如1000mm?）。在整个实验过程中，将动物保持在室温（22°C±3°C）下，湿度为50％（±20％），光照周期为12小时/12小时。在实验开始前获得了适当的IACUC批准，并遵循了所有动物的伦理治疗。

结果

根据肿瘤生长速度，观察时间为2-10周。当使用VitroGel或AB-ECM时，发现所有六种实体瘤来源的细胞系都成功形成了实体瘤；肿瘤类型和形态相似。对于所有细胞类型，AB-ECM和VitroGel的平均生长速度几乎相似（表2；图2）。对于所有六种细胞类型，发现AB-ECM和VitroGel水凝胶达到预定肿瘤大小所需的时间相同。肿瘤生长大小超过2000mm?或在任何一个维度上超过2cm的小鼠被忽略。在大多数情况下，使用VitroGel移植的肿瘤也显示出较低的标准差，这意味着VitroGel是一个可靠的系统，具有较小的变异性和更高的批间一致性。这些特征证明了VitroGel水凝胶作为AB-ECM的无外源替代品的效率，使其成为具有应用便利性的有前途的替代品。凭借长期可注射状态、批量样品制备和易于使用的室温操作等优越性能，VitroGel因此成为体内研究的强大工具。

 表2. VitroGel中所有六种细胞类型的肿瘤生长终点时间和肿瘤大小。

 图2. 所有六种细胞系的肿瘤生长曲线。

讨论

如图2所示的肿瘤生长曲线表明，所有测试的六种细胞类型都成功形成了实体瘤。AB-ECM和VitroGel达到预定肿瘤大小所需的时间相当，表明VitroGel作为体内应用的基于动物的细胞外基质的有前途的替代品的功效。

除了上述六种细胞类型外，VitroGel水凝胶基质还支持许多异种移植模型和细胞类型：乳腺（Hs578T，MDA-MB-231）、白血病（CCRF-CEM，Reh）、肺癌（A549，H2170）、黑色素瘤（A375）、胰腺（ASPC-1）、口腔（HSC-2）、纤维肉瘤（HT1080）、肾（786-O）、舌（CAL-27）等。

除了肿瘤生长成功，加上注射后没有毒性迹象，VitroGel作为一种系统，为癌症科学家带来了许多实际好处。它有助于应对在注射前过程中保持4°C恒定低温的挑战，使其在没有冰或不方便使用冰时更灵活地使用。注射前均匀的细胞悬浮液，随后是顺畅的注射给药，确保了可重复性。与AB-ECM相比，VitroGel具有批间一致性，是长期分析的可靠系统。

该系统不仅旨在替代AB-ECM，还为科学家提供了控制他们希望添加的补充剂和生长因子的能力。这种合成水凝胶系统允许科学家操纵关键的生物物理和生物学特性，如机械强度、功能配体和微环境的可降解性。因此，它代表了一种强大的生物相容性工具，让人们能够创建许多天然ECM无法做到的独特测定。除了异种移植，可注射的VitroGel系统还适用于其他体内应用，如细胞治疗、药物递送和伤口愈合。4-8

链接到使用的产品

1. Ready-To-Use VitroGel Hydrogel Matrix，VHM01S，VHM01

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