如何选择正确的His标签纯化树脂或磁珠的类型

多组氨酸或His 6标签是一种蛋白质标签，最初于1988年开发，用于高效纯化蛋白质而开发的蛋白标签。由于其相对较高性价比，它被认为是迄今为止最广泛使用的蛋白质亲和标签之一。由于其小尺寸，可在四到十个氨基酸之间变化，His很少干扰目标蛋白质的功能。此外，其低免疫原性和在天然及变性条件下的多功能性，使这种蛋白质标签在众多标签中脱颖而出。His标签的底层纯化原理是金属离子与组氨酸的咪唑环之间的相互作用。

通过His标签对蛋白质进行纯化是通过不同的二价金属离子（如Ni2+，这是最常用的离子）与组氨酸的基本咪唑环之间的相互作用来实现的。His标签能够在中性到略微碱性的pH值（7.5至8是典型的）下与这些金属离子结合。值得注意的是，这两种相互作用伙伴之间的结合亲和力与His标签的长度成正比。与His6标签相比，His10标签能够实现十倍的结合亲和力。然而，作为首次尝试，建议尽量减少组氨酸残基的数量，以避免可能对蛋白质功能造成干扰。在纯化过程的后期阶段，可以通过将pH值降低到4-5来洗脱蛋白质，尽管应该注意到有些蛋白质在这样的低pH值下会发生变性。此外，大多数科学家更倾向于通过更高浓度的咪唑（100-500 mM）进行竞争性洗脱。还建议在装载和洗涤缓冲液中加入低摩尔浓度的咪唑（5-20 mM，很少达到80 mM），以减少非特异性结合事件，因为一些内源性蛋白质或天然存在的组氨酸能够对IMAC树脂显示出微弱的结合。每种蛋白质的最佳条件应始终单独确定。

亲和纯化步骤

1. 结合：含有His标签蛋白质的粗溶液被加到柱子上，并基于亲和标签-基质相互作用进行结合。

2. 洗涤：其他非特异性结合的蛋白质被适当的洗涤缓冲液冲走。这些缓冲液中应该已经含有低摩尔浓度的咪唑。

3. 洗脱： 特异性结合的蛋白质从柱子上洗脱，通常是通过类似分子的竞争性结合（例如组氨酸和咪唑）、通过蛋白酶切割标签，或者通过改变pH值破坏亲和标签-基质相互作用来实现。然后可以将纯化的洗脱液收集到反应管中，以供进一步研究。

通过His标签的蛋白质纯化通常是通过固定金属亲和色谱法（immobilized metal affinity chromatography，IMAC）实现的。这是一种广泛使用的纯化方法，用于从溶液中分离对金属离子（如Ni2+或Co2+）具有亲和力的蛋白质和肽段。对蛋白质进行His标签化，可以使新形成的融合蛋白与螯合金属结合，从而在很少的步骤中实现大量的富集。常用的螯合剂作为配体是IDA和NTA琼脂糖树脂。它们可以很容易地与二价金属配对，这取决于所需过程的亲和力/特异性比率。

三种配体（IDA，NTA&INDIGO-Ni）及其镍结合能力的比较

选择正确的His标签纯化树脂或磁珠的类型基于三个因素：

配体：这是金属离子在螯合物复合物中与之结合的分子。Cube Biotech可提供三种不同的配体。

NTA：氨三乙酸是最常用的配体。

IDA：亚氨基二乙酸是第二常用的配体。NTA对比IDA:IDA树脂价格较低；NTA树脂能得到纯度更高的蛋白；NTA树脂的金属离子脱落量明显较少；NTA树脂对还原剂和螯合剂有更强的抵抗力。

INDIGO：这种配体是在Cube Biotech开发的。它的优势之一是大大提高了DTT和EDTA的耐受性。这种新型INDIGO配体装载镍离子。使用INDIGO配体，使得在高达20 mM DTT和20 mM EDTA的高蛋白质容量下纯化his标记的蛋白质成为可能。

耦合的金属离子：根据与配体耦合的金属离子，His标签纯化的亲和力和特异性会发生变化。铜具有最高的亲和力，但同时具有最低的特异性。钴则位于光谱的另一端。镍是最常用的金属离子，它在亲和力和特异性之间取得了良好的平衡。经验法则：蛋白质产量越高，纯化过程的特异性就越低。

珠子的大小：使用的珠子直径越大，FPLC纯化的流速越高。这使它们更适合粘稠的细胞介质或批量纯化。然而，通常使用较慢的流速可以增加蛋白质产量，因为较小的珠子具有更高的表面积与体积比。因此，相同体积的树脂可以比更大尺寸的珠子结合更多的蛋白质。Cube Biotech提供的珠子直径有30微米、40微米、100微米和XL尺寸（约400微米）。

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