SRE eGFP 报告基因 - HEK293 细胞系（ERK 通路）

MAPK/ERK信号通路是细胞生长和分化的关键调节器。它可以被多种细胞外刺激激活，包括促有丝分裂素、生长因子和细胞因子。在刺激后，MEK1/2磷酸化并激活ERK1/2。激活的ERK转移到细胞核中，在那里它磷酸化并激活转录因子。三元复合体因子（TCFs），包括Elk1，是ERK1/2转录因子底物中最好表征的之一。当被ERK1/2磷酸化时，Elk1与血清反应因子（SRF）形成复合体，并结合到血清反应元件（SRE），导致多种有丝分裂原诱导基因的表达。

重组HEK-293细胞表达在SRE响应元件控制下的增强型绿色荧光蛋白（eGFP）。这种细胞系已经验证了其对EGF或血清刺激以及ERK信号通路抑制剂的处理的反应。

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细胞培养所需的培养基：

解冻培养基1（BPS Bioscience #60187）：

MEM培养基，补充10% FBS、1%非必需氨基酸、1 mM Na、1%青霉素/链霉素

生长培养基1J（BPS Bioscience #79552）：

MEM培养基，补充10% FBS、1%非必需氨基酸、1 mM Na、1%青霉素/链霉素和500 ?g/ml的遗传霉素/G418

检测培养基1：解冻培养基1（BPS Bioscience #60187）

检测培养基1B（BPS Bioscience #79617）：

MEM培养基，补充0.5% FBS、1%非必需氨基酸、1 mM Na焦磷酸盐、1%青霉素/链霉素

细胞培养协议：

细胞解冻：

1. 为了解冻细胞，建议在37°C水浴中将冷冻细胞旋转30-40秒，然后用1-2 ml解冻培养基1完全解冻细胞。将整个瓶中的内容转移到含有10 ml解冻培养基1（不含遗传霉素/G418）的管中。

2. 离心细胞，去除上清液，然后在5 ml预热的解冻培养基1（不含遗传霉素/G418）中重悬细胞。

3. 将重悬的细胞转移到T25或T75培养瓶中，并在37°C、5% CO2培养箱中培养。

4. 培养24小时后，检查细胞附着和活力。更换为新鲜的解冻培养基1（不含遗传霉素/G418），并在37°C、5% CO2培养箱中继续培养，直到细胞准备好分裂。

5. 细胞应在完全融合前分裂。在第一次传代时，切换到生长培养基1J（含遗传霉素/G418）。

细胞传代：

1. 传代细胞时，去除培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞，并用0.05%胰酶/EDTA从培养容器中分离细胞。

2. 分离后，加入生长培养基1J（含遗传霉素/G418），转移到管中，离心细胞，然后在生长培养基1J中重悬细胞，并将适当的细胞悬浮液等分到新的培养容器中。次培养比例：每周1:6至1:8或每周两次。

细胞冷冻：

1. 为了冷冻保存细胞，去除培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞，并用0.05%胰酶/EDTA从培养容器中分离细胞。

2. 分离后，加入解冻培养基1（不含遗传霉素/G418），计数细胞，然后转移到管中，离心细胞，并在4°C冷冻培养基（BPS Bioscience #79796或10% DMSO + 90% FBS）中重悬，细胞浓度约为2 x 10^6细胞/ml。

3. 将1 ml的细胞等分到冷冻瓶中。将瓶子放入绝缘容器中缓慢冷却，并在-80°C下过夜保存。

4. 次日转移到液氮中保存。

注意：建议扩展细胞并在早期传代时至少冷冻10瓶细胞以备将来使用。

SRE-eGFP报告基因HEK293细胞对EGF或血清的反应：

1. 从生长培养基1J中收获SRE-eGFP报告基因HEK293细胞，并将细胞以每孔约50,000个细胞的密度播种到24孔组织培养板中，每孔0.5 ml的解冻培养基1（见上文）。

2. 在37°C、CO2培养箱中培养细胞过夜。

3. 从孔中去除培养基，并用0.5 mL的检测培养基1B（含0.5% FBS）替换。

4. 在37°C、CO2培养箱中培养细胞72小时。

5. 从孔中去除培养基，并用检测培养基1B（0.5% FBS）或检测培养基1（10% FBS）中的理想剂量的人重组EGF替换。

6. 在37°C、CO2培养箱中培养细胞48小时。

7. 使用荧光显微镜或流式细胞仪（Ex/Em=488/510 nm）分析eGFP表达。

实验时间：SRE-EGFP报告HEK293细胞对EGF或血清的反应

图1. EGF或血清诱导SRE-eGFP报告基因在SRE-eGFP报告基因HEK293中的表达。报告的数据来自流式细胞仪分析，并以FITC通道的均值荧光强度信号呈现，每个条件3次重复。

BPS Bioscience是一家通过ISO 9001:2015认证的生命科学领域的供应商，公司一直致力于开发药物研发领域的重组蛋白酶、蛋白酶活性/抑制剂筛选试剂盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年创立，从创立至今一直致力于提供药物研发领域的创新解决方案，以推动新的药物发现。公司主要关注的领域包括免疫疗法、表观遗传学、新型冠状病毒、CRISPR、细胞信号转导等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、组蛋白去甲基化酶、组蛋白甲基化转移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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