Cas9-表达 HEK293 细胞系-快速生成敲除细胞池或细胞系

Cas9（化脓性链球菌CRISPR相关蛋白9）是一种内切酶，当被sgRNA（单导向RNA）引导到特定的DNA序列时，会在DNA中引入双链断裂。这种双链断裂在哺乳动物细胞中通过非同源末端连接或同源重组进行修复。非同源末端连接通常导致在切割位点处删除或插入几个碱基对，当导致移码突变时，会引起目标基因的功能失活。表达Cas9的HEK293细胞可以通过转导或电穿孔sgRNA针对感兴趣的基因，快速生成敲除细胞池或细胞系。

这条细胞系是通过从稳定转染Cas9慢病毒（BPS Bioscience #78066）的细胞群体中进行限制稀释得到的。基于Cas9表达筛选出的孤立克隆，以获得高表达的细胞系。表达的Cas9蛋白包含一个C末端FLAG标签。

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应用

1. 在HEK293细胞中快速生成敲除细胞池或细胞系。

2. 在表达Cas9的HEK293细胞中实施sgRNA筛选。

推荐细胞培养条件

冷冻细胞：

1. 准备一个T-75培养瓶，加入20毫升预热的解冻培养基6（不含普鲁霉素）。

2. 在37°C水浴中不断缓慢摇晃以快速解冻细胞。

3. 用70%乙醇清洁瓶外后，立即将全部内容物转移到解冻培养基6（不含普鲁霉素）。避免上下吹打，轻轻摇晃培养瓶以分散细胞。

4. 在37°C、5% CO2的湿润培养箱中培养细胞。

5. 培养24-48小时后，更换为新鲜的生长培养基6C（含普鲁霉素），不要扰动已附着的细胞。

6. 继续每2-3天更换一次培养基，直到细胞达到所需的密度。

传代：

1. 当细胞达到90%密度时，去除生长培养基6C，并用不含镁或钙的PBS洗涤两次。

2. 用2-3毫升0.25%胰蛋白酶/EDTA处理细胞，并在37°C下培养2-3分钟。

3. 通过光学显微镜确认细胞脱落后，加入10毫升预热的生长培养基6C，并轻轻上下吹打以分散细胞团。

4. 将细胞转移到15毫升锥形管中，并以200 x g的速度离心5分钟。

5. 去除培养基，并将细胞在10毫升预热的生长培养基6C中重悬。

6. 将1毫升细胞悬液分配到新的T75培养瓶中，其中含有预热的9毫升生长培养基6C（推荐的传代比例为1:2至1:10）。

7. 在37°C、5% CO2的湿润培养箱中培养细胞。

冷冻保存：

1. 当细胞达到90%密度时，如上所述使用胰蛋白酶从培养板中移除细胞，离心细胞并从沉淀中去除培养基。

2. 将细胞在冷冻培养基（FBS中的10% DMSO）中重悬。

3. 使用减慢速率冷冻盒（每分钟下降-0.5°C至-1°C）将细胞冷冻至-80°C，然后将细胞移至液氮中长期储存。

已证明细胞至少稳定15代；BPS建议尽早准备冷冻库存，以免细胞使用超过20代。

图1. HEK293细胞内Cas9表达的流式细胞仪分析。

细胞用PE标记的抗FLAG抗体（BioLegend，#637309）染色，并通过流式细胞仪分析。亲本HEK293细胞以绿色显示，表达Cas9的HEK293细胞系（BPS Bioscience，#78166）以蓝色显示。

BPS Bioscience是一家通过ISO 9001:2015认证的生命科学领域的供应商，公司一直致力于开发药物研发领域的重组蛋白酶、蛋白酶活性/抑制剂筛选试剂盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年创立，从创立至今一直致力于提供药物研发领域的创新解决方案，以推动新的药物发现。公司主要关注的领域包括免疫疗法、表观遗传学、新型冠状病毒、CRISPR、细胞信号转导等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、组蛋白去甲基化酶、组蛋白甲基化转移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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