从甲基化到去甲基化：解码TET酶驱动的DNA表观修饰密码

DNA甲基化是最广泛研究的表观遗传修饰，涉及在胞嘧啶碱基的第5位添加甲基基团，生成5-甲基胞嘧啶（5-mC）。此外，从5-甲基胞嘧啶衍生的其他修饰胞嘧啶核苷酸，包括5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）、5-醛基胞嘧啶（5-fC）和5-羧基胞嘧啶（5-caC）已被发现，并作为活性DNA去甲基化途径的一部分以及可能的表观遗传标记进行研究。这些修饰的胞嘧啶是由TET（Ten-eleven translocation）双加氧酶家族成员对5-mC进行氧化生成的。5-羟甲基胞嘧啶是通过5-甲基胞嘧啶的氧化生成的；5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶则是从5-hmC进一步生成的，也可以直接从5-mC生成。为了推动DNA甲基化和去甲基化研究，EpiGentek提供了一系列用于研究5-mC及其衍生胞嘧啶的产品。

1. 甲基胞嘧啶（5-mC）

5-甲基胞嘧啶（5-mC）是通过在胞嘧啶碱基的第5位添加甲基基团生成的，是研究最多的表观遗传修饰。DNA甲基化通常会抑制基因表达，并一直是研究的热点。它由DNA甲基转移酶（DNMTs）催化，通常发生在CpG二核苷酸位点，尽管在植物和胚胎干细胞中也报道了CpA和CpT位点的非CpG甲基化。在正常体细胞中，大约60%-80%的CpG位点是甲基化的。基因组中某些区域富含CpG二核苷酸，尤其是基因启动子区域，这些CpG密集区域被称为CpG岛。它们通常是未甲基化的，从而允许转录激活和基因表达。异常甲基化被认为在多种疾病的发病机制和进展中起作用，包括癌症。癌症的特征是整体低甲基化，但在某些基因启动子上出现高甲基化，导致许多肿瘤抑制基因的沉默和抑制。

1.1 甲基胞嘧啶（5-mC）定量检测

研究人员通常会从检测样本中5-甲基胞嘧啶（5-mC）的全局水平开始他们的DNA甲基化研究。为此，EpiGentek提供了DNA甲基化（5-mC）整体水平定量检测试剂盒，货号P-1030。该试剂盒利用特异性5-mC抗体，能够检测来自多种物种的片段化以及完整DNA中的5-mC。这种快速简便的一步ELISA法仅需少量DNA即可完成检测，其结果与高效液相色谱（HPLC）方法获得的结果高度一致，但成本更低、通量更高。

1.2 基因特异性的DNA甲基化研究——基于亚硫酸氢盐转化方法

对于基因特异性的DNA甲基化研究，金标准技术是亚硫酸氢盐测序，该技术结合了DNA的亚硫酸氢盐转化和测序。通过亚硫酸氢钠处理DNA，未甲基化的胞嘧啶会被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则对亚硫酸氢钠处理具有抵抗力，仍保持为胞嘧啶。这使得在测序过程中可以区分胞嘧啶的甲基化状态，因为未甲基化的胞嘧啶会被读作胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则会被读作胞嘧啶。为此，EpiGentek提供了DNA甲基化修饰试剂盒, 货号P-1001，适用于从极少量DNA（低至50皮克）开始的亚硫酸氢盐转化。独特的试剂和实验流程可实现极高的转化率，并最大限度地减少DNA降解，从而避免DNA损失。亚硫酸氢盐转化可以与其他下游应用相结合，包括定量PCR（甲基化特异性PCR），为此，EpiGentek还提供了MS-qPCR快速试剂盒，货号P-1028，可用于对亚硫酸氢盐转化后的DNA进行qPCR检测。

1.3 基因特异性的DNA甲基化研究——基于甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）

在基因特异性甲基化研究中使用的其他方法还包括亲和富集方法，用于分离甲基化DNA。为此，EpiGentek提供了MeDIP超敏试剂盒，货号P-1052，用于进行甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）。该试剂盒使用高特异性的抗体从单链或双链DNA片段中免疫沉淀5-甲基胞嘧啶（5-mC），并且每次反应只需50纳克DNA即可进行检测。EpiGentek还提供了EpiQuik组织甲基化DNA免疫沉淀试剂盒，货号P-2020，该试剂盒包含从哺乳动物组织中直接进行MeDIP所需的所有缓冲液和试剂。

除了通过5-mC抗体进行免疫沉淀和富集的方法外，还可以使用甲基-CpG结合域蛋白（MBD）与5-mC结合。MBD蛋白优先在CpG二核苷酸处结合甲基化DNA，EpiGentek提供了两种基于MBD2特异性抗体的甲基化DNA染色质免疫沉淀（ChIP）试剂盒。MBD2 ChIP试剂盒，货号P-2017和组织MBD2 ChIP试剂盒，货号P-2018， 分别适用于细胞和组织样本。使用这些MeDIP和MBD2 ChIP试剂盒富集的甲基化DNA可用于多种下游应用分析，包括微阵列、PCR和测序。

EpiGentek还为研究DNA甲基转移酶（DNMTs）的研究人员提供了多种产品，DNMTs是负责将甲基基团添加到胞嘧啶上的酶。研究人员可以使用DNMT活性/抑制性检测试剂盒(货号P-3139)进行DNMT活性或抑制研究。通过该试剂盒，可以定量测量核提取物或纯化DNMTs中总DNMTs（DNMT1、DNMT3A和DNMT3B）的活性变化。这有助于比较经DNMT抑制剂处理的细胞与未处理细胞中DNMTs的活性水平，以及在酶学研究中测量DNMT活性，其高通量格式能够轻松快速地对多个样本进行检测。此外，EpiGentek还提供了一系列DNMT检测试剂盒，用于定量检测细胞或组织核提取物中，或纯化DNMT制剂中的DNMT1(货号P-3011)、DNMT3A（货号P-3012）和DNMT3B（货号P-3013）蛋白含量。

   在其他DNA甲基化研究中，EpiGentek还提供了5-甲基胞嘧啶单克隆抗体（货号A-1014），该抗体可检测来自广泛物种的5-mC，并适用于在MeDIP研究中富集5-mC、免疫组化（IHC）染色以及用于ELISA检测等多种应用。

2. 5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)

5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）是TET酶氧化5-甲基胞嘧啶（5-mC）的产物，也是活性DNA去甲基化途径中的第一个衍生物。与通常与基因抑制相关的5-mC不同，5-hmC通常与基因激活和表达相关。其最高水平出现在成年大脑中，尤其是在基因编码区域富集；而在胚胎干细胞中，5-hmC与启动子和其他基因调控区域相关。在多种癌症中，5-hmC水平较低，因此被提议作为可能的诊断标志物。

为了测量5-hmC的全局水平，EpiGentek提供了整体水平DNA羟甲基化（5-hmC）定量检测试剂盒（货号P-1032）。通过这种一步ELISA法，可以使用从多种物种的细胞、组织、血浆或血清中分离的DNA来测量5-hmC的全局水平。这是一种高度特异性和灵敏的检测方法，能够检测到低至0.01%的羟甲基化DNA，且与5-mC或未甲基化的胞嘧啶无交叉反应。

2.1 基因特异性的羟甲基化DNA研究——基于羟甲基化DNA免疫沉淀（hMeDIP）

对于基因特异性的羟甲基化DNA测量，EpiGentek提供了羟甲基化DNA免疫沉淀（hMeDIP）试剂盒。该试剂盒使用高度特异性的5-hmC抗体，可以从任何物种的DNA中富集5-hmC，并且富集后的5-hmC可以通过多种下游应用进行分析，包括PCR、微阵列或下一代测序（NGS）。

为了检测TET酶的酶活性——TET酶是将5-mC转化为5-hmC的酶，在DNA去甲基化研究中，EpiGentek提供了5mC-羟化酶TET活性/抑制试剂盒，货号P-3086。通过该试剂盒，可以在核提取物或纯化的TET酶制剂中测量总TET酶的活性或抑制情况。此外，EpiGentek还提供TET1多克隆抗体，可用于5-hmC免疫沉淀和Western Blot（WB）。其他两种TET家族成员TET2和TET3的抗体也适用于免疫组化（IHC）、WB和ELISA。

此外，还可以使用5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）单克隆抗体（货号A-1018）进行其他5-hmC表观遗传学研究，该抗体适用于通过hMeDIP富集羟甲基化DNA、IHC染色以及通过ELISA检测5-hmC等多种应用。这种抗体在广泛物种中表现出色。

3. 5-甲酰基胞嘧啶(5-fC)

5-甲酰基胞嘧啶（5-fC）是由TET家族成员在DNA去甲基化过程中氧化5-甲基胞嘧啶（5-mC）或5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）产生的。5-fC在胚胎干细胞中富集于活跃转录基因的启动子区域，以及增强子和其他基因调控区域。在DNA去甲基化过程中，5-fC可以通过涉及胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）的机制被转化为未修饰的胞嘧啶，随后通过碱基切除修复完成。

为了您的5-fC表观遗传学研究，EpiGentek提供了5-甲酰基胞嘧啶（5-fC）DNA定量试剂盒（货号P-1041），用于测量5-fC的全局水平。该试剂盒适用于所有物种的细胞、组织和体液中的DNA。这种快速简便的比色法检测仅需使用酶标仪，最低可检测到1皮克的5-fC。它已成功用于小鼠和人脑组织以及癌组织中5-fC的定量检测。对于涉及胸腺嘧啶DNA糖基化酶的研究，该酶在5-fC转化为未修饰胞嘧啶的过程中切除5-fC，研究人员可以使用胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）活性/抑制试剂盒（货号P-3094）。这种基于ELISA的试剂盒可以直接测量核提取物或纯TDG酶制剂中的TDG活性或抑制情况，无需耗时的电泳和色谱法。

4. 5-羧基胞嘧啶(5-caC)

6-羧基胞嘧啶（5-caC）是DNA去甲基化过程中产生的最后一个胞嘧啶衍生物。它是通过5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）的连续氧化生成的，先转化为5-醛基胞嘧啶（5-fC），再转化为5-caC；也可以直接从5-甲基胞嘧啶（5-mC）生成。与5-fC类似，5-caC在胚胎干细胞中富集于活跃转录基因的启动子区域，并且也可以被转化为未修饰的胞嘧啶。某些癌症类型中5-caC的水平有所增加。

上述突出介绍的产品只是可用于DNA甲基化和去甲基化研究的产品中的一部分。此外，为了帮助研究人员在表观遗传学研究中节省时间的同时仍能获得出色的结果，EpiGentek还提供多种DNA甲基化和染色质分析的全流程服务，包括亚硫酸氢盐测序、甲基化DNA免疫沉淀测序（meDIP-Seq）、羟甲基化DNA免疫沉淀测序（hmeDIP-Seq）、染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）以及甲基化特异性PCR（MS-PCR）。